AF Mikrojustering Tips fra John Reilly (neuroanatomist) Autofokus mikroadjustering (AFMA) er en prosedyre som gjør det mulig for brukeren å korrigere for små feil ved front - eller bakfokusering. Det er en funksjon som bare er tilstede på visse modeller av Canon dSLRs (for tiden 50D, 7D, 5D Mark II, 1D Mark III, 1D Mark IV, 1Ds Mark III og 1D X). AFMA vil ha størst nytte for linser med raske blenderåpninger (f2.8 og større), fordi den tynne dybdeskarpheten ved brede åpninger gjør at små fokusfeil blir tydeligere. Dette tipset består av to hovedavsnitt, et praktisk oppsummering av prosedyren for de som vil dykke rett inn, etterfulgt av mer teknisk diskusjon, inkludert noen DIY-alternativer for en testoppsett. Den enkleste måten å utføre en AFMA er med et kommersielt verktøy, for eksempel LensAlign MkII eller DataColor SpyderLensCal (se diskusjonen nedenfor for en forklaring på vanlige feil i utskrivbare testkort og moir-mønstre og en rimelig løsning). Sett opp verktøyet på et bord eller ideelt sett et lite stativ, og sett kameraet på et stabilt stativ. Avstanden mellom kalibreringsverktøyet og kameraet skal være omtrent 25 ganger objektivets brennvidde (f. eks. 85 mm x 25 2,1 m 7 fot), men hvor som helst innen 5-50 ganger brennvidden vil fungere. Merk at avstanden på 25x brennvidde er uavhengig av sensorens størrelse. 7 fot ville være passende for en 85 mm linse på APS-C, APS-H eller FF. Hvis du justerer et zoomobjektiv, baserer du avstanden på lengste brennvidde og utfører kalibreringen ved den lengste brennvidden (merk at den nye 1D X lar deg kalibrere et zoomobjektiv med to separate justeringsverdier for den lange og brede ender). For lange linser trenger du en god plass. Mål kameraet slik at midtpunktet er sentrert på fokusmålet, og juster kameraet slik at sensorplanet er parallelt med fokusmålet (ved hjelp av sikringsportene i LensAlign, eller ved å sørge for at begge nivåer er for SpyderLensCal). Belysning er viktig - ideelt, lys konstant belysning for både fokusmål og linjal, med belysning for sistnevnte vinklet for å unngå refleksjon. Jeg foreslår at du bruker et par bordslamper, en lyser linjalen fra høy vinkel, den andre belyser fokusmål. Jeg bruker faktisk tre lamper, hver 150 W-ekvivalent. Heres hvordan det vanlige oppsettet mitt ser ut: Hvis det er praktisk, sett opp for å skyte tethered (du må gå gjennom bilder på 100). Still kameraet i Av-modus, maksimal blenderåpning, og for dette formålet er det best å skyte i JPG med Picture Style-settet til Monokrom (hvis du skyter i farge med et objektiv som 50L eller 85L, vær forberedt på å se mye langsgående CA). Bruk en fjernkontroll eller selvutløser, og speilopphengingsfunksjonen. Åpne C. Fn-innstillingen for AF MicroAdjustment (i AutofocusDrive-delen), og velg 2: Juster etter linse. På dette punktet er det flere måter å ta testbilder på. Du kan iterativt brakett skyte på -20, -10, 0, 10 og 20 og se hvilket par innstillingsbrakett rette fokus på nullpunktet til linjalen, og deretter begrense det videre. Eller du kan skyte ved alle innstillinger fra -20 til 20. Det viktige poenget er å ta flere skudd i hver AFMA-innstilling, ikke bare en eller to, spesielt i regionen der justeringen din slutter, og å ta minst noen bilder som starter fra uendelig fokus og noen som går fra den minste fokusavstanden (MFD). Heres min strategi: Ta ett skudd på null og sjekk for for - eller bakfokus (for eksempel hvis fokalplanet er foran nullpunktet på linjalen, det er forkantfokus). Frontfokus krever positiv justering for å korrigere, bakfokus krever negativ justering. Jeg skyter single shots som starter fra uendelig fokus og gjennomgang ved maksimal zoom på den bakre LCD-skjermen, i trinn på 5 enheter, og deretter innsnevres ytterligere, til jeg har en foreløpig AFMA-innstilling for objektivet. Deretter skyter jeg på totalt 11 AFMA-innstillinger 5 enheter på hver side av mitt forvalg. Ved hver innstilling skyter jeg åtte skudd, to starter fra uendelig, deretter to uten å fokusere, deretter to starter fra MFD, deretter to uten å fokusere på nytt. Jeg overfører bildene til datamaskinen og vurderer dem på 100. DPP vil vise AFMA-innstillingen som en del av EXIF-dataene (eller du kan holde et post-it-notat til målet med gjeldende innstilling). Ignorer noen åpenbart uten fokusfokus, hvor ingen del av linjalen er klar. Jeg finner generelt at når jeg går gjennom bildene, når jeg nærmer seg den beste justeringen, vil skuddene fra uendelig være av, da i beste justering vil de alle være flekk på, da jeg beveger meg bort, vil skuddene fra MFD være av, eller vice versa. For meg tar hele prosessen ca 30 minutter per lenscamera-kombinasjon. Jeg finner ofte at 3-4 justeringsverdier ser bra ut (f. eks. 1 til 3, så jeg bruker bare gjennomsnittet), vanligvis gir et bredere blenderåpning med tynnere DoF et strammere utvalg. Noen andre viktige godbiter: kameraet lagrer opptil 20 objektivspesifikke justeringsjusteringer er av linsetype, så hvis du har mer enn en kopi av et objektiv, kan kameraet ikke fortelle dem fra hverandre (selv om 1D X kan fortelle dem fra hverandre på linse serienummer) en linse pluss forlenger teller som en ekstra linse (og må kalibreres separat fra det blanke objektivet). Det er den korte versjonen for videre detaljer og teori, eller hvis du foretrekker det, hopper du helt til slutt for et DIY-forslag til å erstatte et kommersielt kalibreringsverktøy. Hvorfor er AF mikroadjustering viktig Kameraer og linser er produsert på samlebånd, og toleranser gjelder for enhver produksjonsprosess en ønsket spesifikasjon og en rekke akseptable verdier rundt det. Hvis du er heldig, får du et kamera og objektiv som begge er spot på, eller er av samme mengde i samme retning, og livet er bra. Hvis du har flere linser og orgeler, er sjansene at en eller flere vil trenge litt justering. Den andre faktoren er dybdeskarphet (DoF) jo bredere blenderåpningen, jo grunne DoF. Med relativt smalere åpninger, som f3.5-5.6-spekteret som ofte finnes på forbrukerzoomlinser, er DoF dypt nok til å maskere mindre fokusfeil, så AFMA er ikke så viktig i de tilfellene. Men med raske linser som oppnår grunne DoF er selv små fokusfeil svært tydelige. Før tilgjengeligheten av AFMA var det eneste alternativet for å rette opp disse problemene, å sende kamera (er) og objektiv (er) til Canon, og du måtte sende hele settet til dem. Behovet for profotografer å ha det gjort var en del av grunnen til at Canon lanserte Canon Professional Services. Hva er AF-mikrojustering AFMA korrigerer for bias i AF-systemet, eller på annen måte, forbedrer den globale nøyaktigheten til AF-systemet. Begrepene nøyaktighet og presisjon er noen ganger (feil) brukt utveksling - nøyaktighet er nærhet til sant mens presisjon er repeterbarhet. Her er et diagrammatisk eksempel: AFMA korrigerer for nøyaktighet, men gjør ingenting for presisjon. I virkeligheten beveger den midtpunktet - det gjennomsnittlige fokusplanet for flere målinger. Men det er viktig å huske at presisjon spiller en rolle, så hvis du tester ditt AF-system med bare ett eller et par forsøk, sier tilfeldig tilfeldighet at testen din ikke vil bli spot på grunn av upresisjon. Så, når du tester AF-ytelse, må du utføre flere tester for en gitt linse, og færre tester vil være nødvendig for en f2.8 eller raskere linse på grunn av det høyere nøyaktige AF-punktet som aktiveres av en slik linse. Jeg mistenker at dette er hva som står bak Canons uttalelse om at AFMA kan forhindre riktig fokusering - hvis du baserer en justering på en eller to testbilder, og de skyvene var relativt langt utenfor riktig fokusplan, så vil de fleste av dine etterfølgende bilder i gjennomsnitt savne fokus . Det er verdt å merke seg at selv om vi tester og stiller AFMA basert på dybdeskarphet, er det faktisk påvirket fokusets dybde. Dette er fornuftig, fordi AF-systemet ikke kan kontrollere hva som er foran linsen, men kan kontrollere hva som foregår bak linsen. Dybde av fokus refererer til regionen av kritisk fokus rundt sensoren, og at regionen er en brøkdel av en millimeter tykk. Canon angir nøyaktigheten til AF-systemet for å være innenfor et fokusfokus for en maksimal blenderåpning for AF-punkter med standard nøyaktighet, og innenfor 13 fokusfokus for en maksimal blenderåpning for AF-punkter med høy presisjon som aktiveres av raskere linser (f2.8 midtpunkt på de fleste kropper, f4 midtpunkt på 1-seriens kropper). En enhet av AFMA tilsvarer 18 av fokusfokusen for en gitt lens maksimal blenderåpning. Ingen kamera vil produsere et perfekt fokusert bilde hver gang i hver avstand, og ingen justeringsprosedyre vil endre det. Hva en riktig AFMA kan gjøre er å øke andelen skudd som er riktig fokusert. Er det en enda bedre måte Hvis prosedyren virker som mye arbeid, er det Ja, det er nesten sikkert bedre måter. I et innlegg på Canon Rumours-forumet beskrev bruker epsiloneri en metode for å analysere kontrast av et fokusmål (standardavvik fra pikselintensiteter) og plotte dataene med en parabolisk kurveformet for å bestemme den beste AFMA-innstillingen. Dette ser ut som en veldig nøyaktig metode, men sannsynligvis altfor kjedelig uten en måte å automatisere analysen (for eksempel MATLAB eller ImageJ). I teorien bør det være mulig å oppnå et nøyaktig fokus ved hjelp av kontrastdeteksjon i Live View, der ingen justering er nødvendig fordi bildesensoren brukes til å bestemme beste fokus, og deretter sammenligne det med fasedeteksjon AF og korrigere tilsvarende. I praksis er dette noe vanskelig å gjøre (fordi handlingen med å flytte fokusringen for å se om du var veldig optimalt fokusert endrer fokuset, og du taper nullpunktet). Imidlertid er dette en ide som Canon kunne implementere som en semi-automatisert rutine, dvs. sette opp og justere målet (Canon kunne selge en og passende overbelaste for den som de gjør for andre små stykker plasthud), da kameraet automatisk bestemmer optimal justering. Fil som en under gir, ville det ikke vært fint Hvis det er gjort riktig, vil det være perfekt Nei, AF-systemet vil aldri være perfekt. Det er et par store grunner til det. Den første er at noe system lider av tilfeldighet, alt en nøyaktig AFMA gjør maksimerer frekvensen i fokusbilder du får, men det vil fortsatt være noen savner. Den andre grunnen er at fokusmålet er en ideell situasjon som er flat med høy kontrast. Verden er ikke sammensatt av fokusmål - hvis det var, ville fotografering være ganske kjedelig. Kompleksiteten i ekte verdensscener blir ytterligere forsterket av våre forventninger. Du tar sikte på kameraet og plasserer AF-punktet nøye på funksjonen til motivet du vil fokusere på. Imidlertid kan AF-systemet ikke lese alt du kan gjøre, er å låse på regionen med høyeste faseforskjell innenfor området AF-punktet. Merk at det faktiske AF-punktet er større enn den lille boksen som representerer punktet i søkeren. Selv med Spot AF-funksjonen på visse kameraer (7D, 1D Mark IV og 1D X), som reduserer AF-punktets effektive størrelse, er det faktiske følsomme området lik eller litt større enn representasjonen i søkeren. Så, med bestemte emner, spesielt ved akutte vinkler til kameraet med en tynn DoF, kan AF-punktet låse på en av to forskjellige funksjoner som gir merkbart forskjellige fokusplaner. Begge ville være korrekte så langt som AF-systemet angår. Gratis testmetoder som er galt med dem Det er noen tilnærminger til å utføre AFMA uten et av de kommersielle verktøyene. En innebærer å sette opp et moir-induserende mønster på en datamaskinkamera, og evaluere fokus basert på Live View på kameraets bakre LCD. Det er en ganske enkel metode, men det har to problemer. For det første er det vanskelig å justere oppsettet slik at sensoren er parallell med LCD-skjermen. For det andre har jeg funnet ut at det er mye presisjon i metoden når man ser på et moirermønster på 10x Live View, kameraet kan flyttes frem og tilbake ganske uten å se en merkbar forandring i mønsteret på baksiden av LCD-skjermen. Den andre gratis tilnærmingen innebærer et diagram som du laster ned og skriver ut, plasser deretter i 45 vinkler til kameraet ditt, fokuser på en mørk linje og bruk skalaene på sidene for å kontrollere fokus. Problemet med dette er at fokusmål (linje) og DoF-skalaen er i samme 45 plan, så målet er ikke ortogonalt til sensoren. Faktisk er det sannsynligvis den mest populære versjonen av det aktuelle diagrammet som hadde en eldre versjon (fremdeles tilgjengelig) der du skrev ut to sider, så kuttet den opp som den gamle kategorien. En spor B-leker skåret ut av en kornboks og tapet til den andre siden. Skaperen stoppet denne tilnærmingen på grunn av monteringens variabilitet som førte til variable resultater. Den nåværende versjonen bruker en mørk horisontal linje som fokusmål, med begrunnelsen om at fordi linjen er horisontal, spiller det ingen rolle for AF-systemet at siden er i en vinkel, vises den fremdeles som en 2D horisontal linje. Det er sant, men det er bare å optimalisere den horisontale linjefølsomme delen av AF-punktet. På mange kameraer, det kommer ikke til å fungere bra. Nåværende xxD og 7Ds f2.8-sensoren er et par diagonale linjer, noe som betyr at en tynn svart-hvitt linjeorientert horisontalt ikke skal aktivere den sensoren. For RebelxxxD-linjen og 5D5DII er f2.8-sensoren en vertikal linjebasert sensor som ignorerer den horisontale linjen på diagrammet. Så den horisontale linjen går bare til å aktivere den f5.6 horisontale linjebaserte delen av tverrtype sensoren i midten AF-punktet. Du lurer kanskje på hvorfor gjorde fyren diagrammet slik at jeg ville gjette det fordi han designet det til å teste AF på Nikon-kameraer, som ikke har AF-presisjonen med høy presisjon - deres kryss-type sensorer er f5.6- følsom i begge retninger, så et horisontalt mål bør være bra. Jo bedre DIY-tilnærming Hvis du heller ikke vil kjøpe et kommersielt verktøy for AFMA, ville mitt råd være å gjenskape de viktige funksjonene til verktøyene med billige erstatninger. Heres hva jeg anbefaler. Det ville kreve en pappkasse, en bok, et målebånd, en spisepinne eller blyant, og en utskrift av dette fokusmålet (takket være Bob Williams for linken). Det kan settes opp på et bord, eller til og med gulvet om nødvendig. Hvis du har et godt stativ, vil du bruke det i stedet å sette kameraet på en bok. Fokusmålet blir tapet til boksen, ned lavt og knivspisspenningen sitter fast i kanten av boksen, vertikalt sentrert på målet. Hakkestøtten støtter målebåndet i en vinkel. Legg merke til målingene på målebåndet der det passerer ved siden av målet - det er nullpunktet du kan dømme fokus på foran eller bakover (når du vurderer bildene dine på 100 på datamaskinen). Velg en bok med en tykkelse som sentrerer objektivet på omtrent samme høyde som midtpunktet for fokusmålet. Oppsettet vil se slik ut: Jeg håper dette klargjør noen av fallgruvene i AF-systemer og fordelene med og prosedyrene for å oppnå en nyttig AFMA. Glad (og skarp) ShootingNovember 04, 2010 Følgende informasjon er en oppdatert versjon av en metode for å bruke ImageJ for å analysere western blots fra en nå utdatert eldre side. Hvis du ser etter et mer omfattende arbeidsflytalternativ for dine western blot-analyser, kan du gå til min veiledning om bruk av Image Studio Lite. en gratis programvarepakke fra LI-COR Biosciences. Image Studio Lite-programvaren kan lastes ned gratis fra licorislite. I tillegg til funksjonaliteten beskrevet nedenfor for ImageJ, tilbyr Image Studio Lite ytterligere dataadministrasjonsfunksjoner sammen med annoteringsverktøy for å produsere publikasjonsklare bilder av dine vestlige. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) kan brukes til å sammenligne tettheten (aka intensitet) av band på en agargel eller western blot. Denne opplæringen antar at du har båret din gel eller blotte gjennom visualiseringstrinnet, slik at du har et digitalt bilde av gelen din i. tif. jpg. png eller andre bildeformater (en 16-bit. tif ville være det foretrukne formatet for å beholde den maksimale mengden informasjon i det opprinnelige bildet). Hvis du skanner røntgenfilm på en flatbed-skanner, må du sørge for at du bruker en skanner med muligheten til å skanne transparenter (dvs. film), og bruk skannersoftware til å lagre 16-biters tiff-bilder. Se referansene i slutten av denne opplæringen for en diskusjon av de ulike måtene du kan skru opp dette trinnet. Dette forutsetter også at du ikke overbelastte ditt blottbild da du produserte det. For en forklaring på hvorfor overeksponering vil ødelegge resultatene dine, se denne siden. Metoden som er skissert her bruker Gel Analysis-metoden som er skissert i ImageJ-dokumentasjonen: Gel Analysis. Du kan foretrekke å bruke den i stedet for metodene jeg skisserer nedenfor. Det bør være svært lite forskjell mellom resultatene oppnådd fra de ulike metodene. Denne versjonen av opplæringen ble opprettet ved hjelp av ImageJ 1.42q på en Windows 7 64-bit installasjon. 1. Åpne bildefilen ved å bruke FilegtOpen i ImageJ. 2. Gelanalyserutinen krever at bildet skal være et gråskala bilde. Den enkleste metoden for å konvertere til gråtoner er å gå til ImagegtTypegt8-bit. Bildet ditt skal se ut som Figur 1. Figur 1. Et fabrikkert western blot-bilde åpnet i ImageJ. Informasjonen øverst på bildet indikerer at bildet er for tiden i 8-biters modus, ved hjelp av en inverterende LUT (oppslagstabell). Den inverterende LUT sikrer at mørke bånd blir registrert som høyere tetthetsverdier. 3. Velg verktøyet Rektangulært valg fra ImageJ-verktøylinjen. Tegn et rektangel rundt den første banen. ImageJ antar at banene dine løper vertikalt (så enkelte bånd er horisontale), så rektangelet skal være høyt og smalt for å legge til en enkelt bane. Hvis du tegner et rektangel som er kort og bredt, vil ImageJ bytte til å antar at banene løper horisontalt (enkelte bånd er vertikale), noe som fører til mye forvirring. Figur 2. Den første banen er valgt med verktøyet Rektangulært valg 4. Når du har tegnet rektangelet over den første banen, trykker du på tasten 1 (Kommandoen 1 på Mac) (Kommando 1 på Mac) eller går til AnalysegistrertGelg VelgVelg for å angi rektangel på plass. Første lane vil nå bli uthevet og ha en 1 i midten av den. 5. Bruk musen til å klikke og hold midt i rektangelet på 1. lane og dra den over til neste lane. Du kan også bruke piltastene til å flytte rektangelet, selv om dette er tregere. Senter rektangelet over banen til venstre, men ikke bekymre deg om at det er perfekt på samme vertikale akse. Image-J vil automatisk justere rektangelet på samme vertikale akse som det første rektangel i neste trinn. 6. Trykk 2 (Command 2 på Mac) eller gå til AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane for å sette rektangelet på plass over 2. lane. A 2 vises i banen når rektangelet er plassert. 7. Gjenta trinn 5 6 for hver påfølgende lane på gelen, og trykk 2 (Command 2 på Mac) hver gang for å sette rektangelet på plass (figur 3). Figur 3. Plasser rektangelet over hver bane, trykk 2 hver gang for å sette rektangelet på plass. 8. Etter at du har satt rektangelet på plass på siste felt (ved å trykke 2), trykk 3 (Kommando 3 på Mac), eller gå til AnalyzegtGelsgtPlot Lanes for å tegne en profilplan for hver lane. Figur 4. Profilbildet fra eksempelet western blot. 9. Profilbildet representerer den relative tettheten av innholdet i rektangelet over hver bane. Rektanglene er ordnet opp til bunn på profilplottet. I eksempelet western blot-bilde svarer toppene i profilplottet (figur 4) til de mørke båndene i det opprinnelige bildet (figur 3). Fordi det var valgt fire baner, er det fire seksjoner i profilplottet. Høyere topper representerer mørkere bånd. Bredere topper representerer band som dekker et bredere størrelsesområde på den opprinnelige gelen. 10. Bilder av ekte gels eller western blots vil alltid ha noe bakgrunnssignal, slik at toppene don8217t kommer ned til grunnlinjen til profilplottet. Figur 5 viser en topp fra en ekte flass hvor det var litt bakgrunnsstøy, så toppen ser ut til å flyte over grunnlinjen til profilplottet. Det vil være nødvendig å lukke toppen slik at vi kan måle størrelsen. Figur 5. Real western blots har ofte litt bakgrunnsstøy, slik at toppen ikke nås til grunnlinjen (perfekt hvit). 11. Velg verktøylinjen Straight Line (Bilde 6). For hver topp du vil analysere i profilplottet, tegne en linje over toppen av toppen for å legge toppen (figur 5). Dette trinnet krever noen subjektiv vurdering fra din side for å bestemme hvor toppen slutter og bakgrunnsstøyen begynner. Figur 6. Bruk rettlinjeverktøyet til å lukke bunnen av hver topp av interesse. Figur 7. Toppet fra figur 5 er vist med en linje trukket over toppen av toppen for å omslutte toppområdets område. 12. Merk at hvis du har markert mange baner, vil de senere banene være skjult nederst på profilplottvinduet. For å se disse banene, trykk og hold mellomromstasten, og bruk musen til å klikke og dra profilplottet oppover. 13. Når hver topp er stengt ved basen med verktøylinjen Straight Line, velg Wand-verktøyet fra ImageJ-verktøylinjen (Figur 8). Figur 8. Velg Wand-verktøyet for å markere hver topp av interesse på profilplottet. 14. Bruk mellomromstasten og musen til å dra profilplanen nedover til du er tilbake på første kjørefelt. Med Wand-verktøyet klikker du inne i toppen (Figur 9). Gjenta dette for hver topp mens du går ned på profilplottet. For hver topp som du markerer, må målinger dukke opp i resultatvinduet som vises. Figur 9. Klikk inn i den første toppen av interesse med Wand-verktøyet. Toppet skal utheves og en måling skal dukke opp i resultatvinduet. 15. Når alle toppene har blitt uthevet, gå til AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Dette merker hver topp med sin størrelse, uttrykt som en prosentandel av den totale størrelsen på alle de fremhevede toppene. 16. Verdiene fra resultatvinduet (Figur 10) kan flyttes til et regnearksprogram ved å velge EditgtCopy All i resultatvinduet. Lim inn verdiene i et regneark. Figur 10. Utgangen fra valg av topper i profilplottet og merking av toppene. I dette tilfellet er resultatene fra å velge det øvre båndet i hver av de 4 banene i eksemplet western blot fra figur 1. Merk: Hvis du ved et uhell klikker på feil sted med Wand. Programmet registrerer fortsatt som klikket område som topp, og det vil faktorere i det totale arealet som brukes til å beregne prosentverdiene. Selvfølgelig vil dette skje resultatene dine hvis du klikker på områder som aren8217t toppene. Hvis du tilfeldigvis klikker på feil sted, går du enkelt til AnalyzegtGelgtLabel Peaks for å plotte de nåværende resultatene, som viser feilverdiene, men nullstiller telleren for resultatvinduet enda viktigere. Gå tilbake til profilplottet og begynn å klikke inne i toppene igjen, begynner med den første toppen av interesse. Resultatvinduet skal slette og begynne å vise de nye verdiene. Når du er sikker på at du klikker i alle de riktige toppene uten å klikke ved et uhell på noen feilområder, kan du gå tilbake til AnalyzegtGelsgtLabel Peaks og få de riktige resultatene. Dataanalyse Med dataene limt inn i et regneark, kan du nå beregne den relative tettheten av toppene. Som en påminnelse er verdiene som beregnes av ImageJ, hovedsakelig vilkårlige tall, de har bare mening i sammenheng med settet av topper som du valgte på det enkelt gelbildet du har jobbet på. De har ikke enheter av g protein eller andre virkelige enheter som du kan tenke på. Den normale prosedyren er å uttrykke tettheten til de valgte bandene i forhold til noen standardbånd som du også valgte i løpet av denne prosessen. 1. Plasser dataene dine i et regneark. En av toppene bør være din standard. I dette eksemplet bruker we8217ll den første toppen som standarden. 2. I en ny kolonne ved siden av kolonnen Prosent deles prosentverdien for hver prøve med prosentverdien for standarden (den første toppen i dette tilfellet, 26.666). 3. Den resulterende kolonnen av verdier er et mål på den relative tettheten i hver topp sammenlignet med standarden, som åpenbart vil ha en relativ tetthet på 1. Figur 11. Beregner relativ tetthet for hver av de 4 fremhevede topper. Vi bruker prøve 1 som standard for denne gelen. Relativ tetthet beregnes ved å dele prosentverdien for hver prøve med prosentverdien for standarden. 4. I dette eksemplet har den andre bane en høyere relativ tetthet (1,86), som tilsvarer godt med størrelsen og mørket i båndet i det opprinnelige bildet (figur 1). Husk at disse dataene er for den øvre rækken av bånd på det opprinnelige western blot-bildet. 5. Hvis du vil sammenligne tettheten av prøver på flere geler eller flekker, må du bruke samme standardprøve på hver gel for å gi en felles referanse når du beregner Relative Density-verdiene. Se seksjonene nedenfor for en nærmere beskrivelse av disse kravene. 6. For å teste for signifikante forskjeller mellom behandlinger i et eksperiment, må alle dine geler eller blotter skannes og kvantifiseres ved hjelp av denne metoden, og verdiene vil bli uttrykt i forhold til relativ tetthet, eller du kan behandle relativ tetthet som en fold-endringsverdi (dvs. en relativ tetthetsdifferanse på 2 mellom en kontroll og en behandling vil indikere en 2-gangs endring i uttrykket). Hvis du skal bruke analysen av variantteknikker for å teste dataene dine, må du kanskje sørge for at relativ tetthet verdier er normalt fordelt og at det er homogenitet av varians blant de ulike behandlingene. 7. Det bør bemerkes her at enkelte forskere gjør ekstra innsats for å inkludere et sett med serielle fortynninger av en kjent standard på hver blot. Ved bruk av seriell fortynningskurve og kvantifiseringsteknikker som er skissert ovenfor, bør det være mulig å uttrykke prøvebåndene dine i form av piktogrammer eller nanogrammer av protein. Et mer involvert eksempel ved bruk av lastkontroll. We8217ll bruker figur 12 som en representativ western blot. På denne flekken vil vi late som vi lastet inn fire replikatprøver av protein (fire pipettbelastninger fra samme hetteglass med homogenat), slik at vi forventer at tetthetene i hver bane blir ekvivalente. Den øvre raden av stolper representerer vårt protein av interesse. Det nedre settet av barer representerer vårt lastekontrollprotein, som er ment å sikre at en lik mengde totalt protein ble lastet i hver bane. Dette lastekontrollproteinet er et protein som antas å være uttrykt på et konstant nivå, uavhengig av behandlingen som brukes på de opprinnelige organismer, for eksempel aktin (selv om mange vil stille spørsmål om at aktin vil bli uttrykt likeverdig på tvers av behandlinger). Figur 12. Et eksempel på western blotting med en nedre rad belastningsbånd. Ofte vil disse bandene representere et protein som antas å bli uttrykt likeverdig i alle behandlinger, for eksempel actin. Ser vi på figur 12, hadde vi håpet å laste tilsvarende mengder totalt protein i hver bane, men etter å ha kjørt den vestlige blottet varierer størrelsen og intensiteten til de nedre bjelkene i hver bane ganske mye. De to venstre banene virker likeverdige, men den tredje banen har halv tetthet (grå verdi) sammenlignet med banene 12, mens bane 4 har halv tetthet og halve størrelsen i forhold til baner 12. Fordi belastningskontrollene våre er så forskjellige, verdier av det øvre settet av bånd kan ikke være direkte sammenlignbare. We8217ll bruker ImageJ8217s gelanalyseringsrutine for å kvantifisere tettheten og størrelsen på blottene, og bruk resultatene fra våre lastkontroller (lavere bånd) for å skalere verdiene for vårt protein av interesse (øvre bånd). 1. Åpne western blot-bildet i ImageJ. 2. Kontroller at bildet er i 8-biters modus: gå til ImagegtTypegt8-bit. 3. Bruk rektangulærverktøyet til å tegne en boks rundt hele 1. lane (både øvre og nedre søyle inkludert. 4. Trykk på 822018221 (eller Kommando 1 på Mac) for å sette rektangelet. A 822018221 skal vises midt i rektangelet. 5. Klikk og hold midt i rektangelet, og dra det over 2. lane. 6. Trykk 822028221 (Command 2 på Mac) for å sette rektangelet for lane 2. A 822028221 skal vises midt i rektangelet. Gjenta trinn 5 6 for hver påfølgende lane, trykk 822028221 (Command 2 på Mac) for å sette rektangelet over hver etterfølgende lane (se figur 13). Figur 13. Hver lane er valgt ved å flytte rektanglet over det og trykke 822028221 for å sette rektangelet på plass. 8. Når du har lagt den siste banen (og trykket 822028221 for å sette den på plass), kan du trykke 822038221 for å lage et plott av de valgte banene (se figur 14). Figur 14. Profilplott av hver lane (ordnet med lane 1 øverst, lane 4 nederst). Du må kanskje bla gjennom t han vindu for å se alle banene. 9. Profilbildet representerer i hovedsak gjennomsnittlig tetthetsverdi over et sett med horisontale skiver av hver bane. Mørkere blotter vil ha høyere topper, og blott som dekker et større størrelsesområde (kD), vil ha større topper. I vårt eksempel western blott er bandene perfekte rektangler, men du vil legge merke til en viss skråning i profilplottingstoppene, da ImageJ bruker litt gjennomsnittlig tetthetsverdier når den beveger seg fra topp til bunn av hver bane. Som et resultat blir den skarpe overgangen fra perfekt hvitt til perfekt svart på båndene i bane 1 oversatt til en svak helling på profilplottet på grunn av gjennomsnittet. 10. På vår idealiserte western blot brukt her, er det ingen bakgrunnsstøy, så toppen når helt ned til grunnlinjen til profilplottet. I ekte western blots vil det være bakgrunnslyd (bakgrunnen vil ikke være helt hvit), så toppene vant8217t når grunnlinjen til profilplottet (se figur 5 ovenfor). Som et resultat vil hvert tomt måtte ha en linje trukket over toppen av toppen for å lukke den av. 11. Velg verktøylinjen for straight line-linjen fra ImageJ-verktøylinjen. For hver topp du vil analysere i profilbildet, tegne en linje over toppen av toppen for å legge toppen (figur 7). Dette trinnet krever noen subjektiv vurdering fra din side for å bestemme hvor toppen slutter og bakgrunnsstøyen begynner. 12. Når hver topp av interesse er avsluttet med rettlinjeverktøyet, bytt til Wand-verktøyet. Vi vil bruke verandaverktøyet til å markere hver maksimal interesse, slik at Image-J kan beregne dens relative areadensitet. 13. Vi vil begynne med å markere lastekontrollbåndene (nederste rad) på vårt eksempel western blot. Begynn på toppen av profilplottet, bruk staven til å klikke inne i den første toppen (Figur 15). Toppet bør utheves etter at du har klikket på det. Fortsett å klikke på lastekontrolltoppene for de andre banene. Hvis en bane ikke er synlig nederst på profilplottet, hold nede mellomromstasten og klikk og dra profilprofilen oppover for å avsløre gjenværende baner. Figur 15. Klikk innsiden av lastestyringstoppen med stengeværktøyet. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed. Tau Pathology Induces Excitatory Neuron Loss, Grid Cell Dysfunction, and Spatial Memory Deficits Reminiscent of Early Alzheimers Disease Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y. Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4 ,. Karen E. Duff 1,2,3,5 ,. 1 Taub Institute for Research on Alzheimers Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Department of Integrative Neuroscience, New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA Received 20 July 2016. Revised 20 October 2016. Accepted 15 December 2016. Available online 19 January 2017. Published: January 19, 2017 Highlights Tau pathology induces spatial memory deficits in old, but not young, EC-Tau mice Aged EC-Tau mice exhibit grid cell hypoactivity and reduced periodicity Excitatory, but not inhibitory, MEC neurons are vulnerable to tau pathology Altered neuronal activity correlates with neurodegeneration in old EC-Tau The earliest stages of Alzheimers disease (AD) are characterized by the formation of mature tangles in the entorhinal cortex and disorientation and confusion when navigating familiar places. The medial entorhinal cortex (MEC) contains specialized neurons called grid cells that form part of the spatial navigation system. Here we show in a transgenic mouse model expressing mutant human tau predominantly in the EC that the formation of mature tangles in old mice was associated with excitatory cell loss and deficits in grid cell function, including destabilized grid fields and reduced firing rates, as well as altered network activity. Overt tau pathology in the aged mice was accompanied by spatial memory deficits. Therefore, tau pathology initiated in the entorhinal cortex could lead to deficits in grid cell firing and underlie the deterioration of spatial cognition seen in human AD. tau pathology Alzheimers disease entorhinal cortex grid cells neuronal loss cognitive deficits neurofibrillary tangles spatial memory electrophysiology hypoactivity Figure 1. Figure 2. Figure 3. Figure 4.
No comments:
Post a Comment